二倍体 中华 猕猴桃核 型 与 初级 分化 的 性 染色体 形态 (

(1. 中国 科学院 武汉 植物 研究所 ， 武汉 430074；2. 复旦 大学 生命 科学 学院 、 生物 多样性 与 生态 工程 教育部 重点 实验室 ， 上海 200433；3. 中国 科学院 植物 研究所 ， 北京 100093；4. 华中 农业 大学 研究生 院 ， 武汉 430070）

摘要 	猕猴桃 植物 的 染色体 形态 观察 极为 困难 ， 其 性 染色体 存在 与否 也 存在 争议 。 本 文 首次 确定 了 二倍体 中华 猕猴桃体 细胞 染色体 核型为2n = 38m + 18sm（2SAT）+ 2t， 最 长 染色体 / 最 短 染色体 为 2. 35, 核 型 类型 为 2B。 带 随体 的 两 条 核仁 染色体 虽 属 同型 染色体 ， 但 其随体 部份 可能 是 与 性别 决定 有关 的 区域 。 在 花 粉母细胞 减数 分裂 的 粗线期 ， 雌 株 的 核仁 二价体 （ 包括 随体 ） 全 长 均 能 紧密 配对 ， 而 雄株核仁 二价体 的 随体 部份 （ 约 占 全 长1/7） 不能 配对 ， 其 部位 染色 粒 大小 与 分布 也 存在 明显 差异 ;雄株核仁 二价体除 上述 随体 以外 的 的 其它 6/7部份 能 完全 配对 。 初步 证实 了 二倍体 中华 猕猴桃 存在 初级 分化 的 性 染色体 ， 性别 决定 类型为xx/xy型 。 粗线期 的 形态 分析 可以 作为 研究 性 染色体 处于 早期 分化 阶段 的 雌雄 异株植物 性别 决定 机理 的 一 个 有效 手段 。 

Karyotype and sex chromosome at primary differentiation stage of Diploid Actinidia chinensis

HE Zican1**, ZHONG Yang1, CAI Qigui2, YE Li3, ZHANG Xiaoyan1, HUANG Hongwen1

(1. Wuhan Institute of Botany, The Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China;
2. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering of Ministry of Education, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China;
3. Institute of Botany, The Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China;
4. The Graduate School, Huazhong Agriculture University, Wuhan 430070, China)

Abstract:	The karyotype of diploid Actinidia chinensis is 2n = 2x = 58 = 38m + 18sm (2SAT) + 2t. The ratio of the largest chromosome to the shortest chromosome is 2. 35 and the karyotype is type 2B. Although the two SAT- chromosomes are similar in length and shape, they are probably the chromosomes related to sex. The SAT region of nucleolar chromosomes may be the region of sex determination. At pachytene stage of pollen mother cell (PMC), the chromosomes in two nucleolar chromosomes of pistillate plant can pair tightly. The SAT region of staminate plant is about 1/7 of the total length and its nucleolar chromosomes are obviously heteromorphic: they cannot pair and the size and distribution of the chromosomes on them exist significant difference, but chromosomes can pair tightly in the remaining 6/7 region, i. e. , non-SAT region. Therefore, it preliminarily confirms that sex chromosomes are at primary differentiation stage and the sex determination mechanism is XX/XY type. The morphological analysis of chromosome at the pachytene stage may be an effective approach to the sex determination mechanism of dioecious plants, which are at primary differentiation stage. 

Key words:	Actinidia chinensis, karyotype, sex chromosome




中华 猕猴桃 （ Actinidia chinensis）为 我国 特有 的 多 年生 雌雄 异株藤 本 植物 。 作为 一 种 新兴 水果 资源 ， 其 形态 解剖 、 营养 成份 和 遗传育 种 等 方面 的 研究 已 较为 深入 [1] ， 但 细胞 遗传学 研究 相对 落后 。 与 其他 高等 植物 相比 ， 中华 猕猴桃 的 染色体 极 小 （ < 1μm）, 呈 点状 ， 基数 极 高 （ X=29） ， 并且 存在 种 内 多 倍体 系列 （ 2n = 58，116） ， 前人 一直 认为 很 难 （ 甚至 有 人 认为 不可能 ） 在 光镜 下 对 其 染色体 形态 进行 描述 [2，3] 。 另一方面 ， 中华 猕猴 桃花 部 结构 为 具 单性花 功能 的 两性 花[4，5] ， 其 性别 决定 机理 及 识别 标记 等 一直 存有 争议 [6-9] 。 性 染色体 的 存在 与否 ， 也 缺乏 直接 的 细胞 学 证据 。 
本 文 采用 改进 的 染色体 制片 技术 ， 对 二倍体 中华 猕猴桃体 细胞 早 中期 染色体 进行 了 核 型 分析 。 通过 研究 雌 株 和雄 株 的 细胞 核 型 与 花 粉母细胞 （ PMCs）减数 分裂 前期 同源 染色体 的 配对 行为 ， 发现 核仁 染色体 与 性别 决定 有关 ， 并 根据 其 特性 确定 性别 决定 类型 。 

材料 与 方法 
以 中国 科学院 武汉 植物 研究所 猕猴桃 种 质 资源 库 从 湖北 、 江西 ， 河南 等 不同 地区 收集 的 野生 二倍体 中华 猕猴桃 为 实验 材料 ， 雌 、 雄株 各 取 3株 ， 体细胞 取 其 茎尖 生长 点 ， 减数 分裂 采用 PMCs。
体 细胞 染色体 标本 的 制备 参考 陈瑞阳 等 （ 1982）报 道 的 方法 [ 10] ， 在 预 处理 和 低 渗 方法 上 略加 改进 ； 用 Olympus-BH光镜 观察 每 个 植株 的 20个 有 丝 分裂 中期 分裂 相 ， 并 进行 染色体 计 数 和 拍照 ； 雌 、 雄株 各 选取 5个 图象 清晰 、 染色体 长度 适中 的 早 中期 有 丝 分裂 相 放大 ， 测量 长度 和 臂 比 ， 以 平均值 作为 参数 ， 按照 Levan (1964) 命名 法[ 11] 进行 核 型 分析 ， 核 型 类型 根据 Stebbins (1971) [ 12] 和 李懋 学 等 (1985) [13]  的 标准 划分 。 
PMCs的减数 分裂 过程 则 进行 全程 观察 ， 染色体 制片 方法 同 前 文[14] ； 雌 、 雄株 不同 时期 各 观察 统计 20个 以上 分裂 相 ， 拍照 、 放大 。 

结果 与 分析 

1．二 倍体 中华 猕猴桃 的 核 型 
二倍体 中华 猕猴桃 雌 、 雄株 所有 计 数 的 染色体 数目 均 为 2n = 2x = 58， 未 发现 非 整倍体 类型 。 根据 早 中期 染色体 相对 长度 和 着丝粒 位置 测量 结果 ， 参考 高 染色体 基数 鱼类 的 核 型 排序 方法 （ 李渝 成 等 1985）[15] , 将 染色体 分为 3组 ： m组 、 sm组 和 t组 。 从 表1和 图版I：1-3中 发现 ： 二倍体 中华 猕猴桃 雌 、 雄株核 型 相同 ， 同源 染色体 均 配对 良好 ， 未见 明显 异形 的 同源 染色体 ； 都 有 19对 具 中部 着丝粒染色体 （ m组 ） ， 9对具近 中 着丝粒染色体 （ sm组 ） （ 其中 1对 为 带 随体 的 染色体 ， 随体 在 短 臂 上 ） ， 1对 具 端着丝粒染色体 （ t组 ） ， 因而 不能 利用 体细胞 染色体 核 型 识别性 染色体 ； 核 型 公式 为 2n = 38m + 18sm（2SAT）+ 2t， 最 长 染色体 / 最 短 染色体 为 2. 35，属 2B型 。 此外 ， 观察到 带 随体 的 核仁 染色体 凝缩稍滞后于 其它 染色体 ， 且 在 形态 和长度 上 表现出 一定 的 多态性 。 

2．二 倍体 中华 猕猴桃PMCs减数 分裂 
二倍体 中华 猕猴桃 部份 雌 株 （ H11、H12） 和雄 株 （ H7） 的 PMCs减数 分裂 过程 不 具有 性别 的 特异性 ， M1、F1和F2期 染色体 配对 情况 和 分离 行为 见 表 2和表3 。 可以 发现 ： 雌 、 雄株M1期 染色体 的 构型 均 以 二价体 为主 ， 每 个 细胞 平均 单价 体 、 二价体 和 四 价 体 出现率 分别 为 0. 28、28. 36和0. 17。F1和F2期 除 正常 现象 外 （ 图版I：4） ， 还 存在 一定 频率 （ 24. 4％ 和 43.7%） 的 落后 染色体 、 染色体 桥 和 染色体 断片 等 异常 细胞 学 行为 （ 表 3） 。 

3．二 倍体 中华 猕猴桃小孢子 的 发育 
二倍体 中华 猕猴桃雌株 小孢子 在 形成 早期 便 停止 发育 并 迅速 形成 空 花粉 粒 ， 发生 选择性 败育 ； 雄株 小孢子 继续 发育 形成 雄配子 体 。 与 美味 猕猴桃 （ A. deliciosa） 相似 [14] ， 在 小孢子 的 发育 阶段 ， 中华 猕猴桃 雌 、 雄株 间 具有 性别 的 特异性 。 

4．二 倍体 中华 猕猴桃 的 性 染色体 
二倍体 中华 猕猴桃 雌 、 雄株29对同源 染色体 在 PMCs减数 分裂 粗线期 ， 除雄 株 的 一 对 核仁 染色体 外 ， 其它 每 对 同源 染色体 基本 全 长 紧密 配对 （ 图版I：7-8） 。 雄株 的 核仁 二价体 与 雌 株 相比较 也 无 明显 异形 ， 仅 在 其随体 的 一 个 狭小 区域 内 可 观察到 配对 上 的 差异 。 雌 株 构成 核仁 二价体 的 2条同源 染色体 同 形同质 ， 它们 在 粗线期 全 长 完全 紧密 配对 形成 完整 的 线形 二价体 ， 其 主要 形态 特 征 是 随体 部位 异 染色质化 并 紧密联会 成为 一 较 大 深染 的 球形 染色 粒 ， 短 臂 近次缢痕 处 和 近 着丝粒区 也 各 有 一 个 异 染色质化 的 较 深染 的 染色 粒 ， 长臂未见 明显 染色 粒 （ 图版I：8，10） 。 该 二价体 双线 期二 个 染色体 开始 分离 的 图象 （ 特别 是 随体 部位 ） 也 显示 其 形态 结构 相同 （ 图版I：8，10） 。 而 雄株构成 核仁 二价体 的 二 条 染色体 在 随体 的 一 个 狭小 区域 内 有 明显 异质性 ， 粗线期 和 双线期 图象 显示 该 部位 不能 联会 ， 且 染色 粒 分布 和 大小 明显 不 对称 ： 一 条 定名为 x染色体 的 随体 形态 特 征 与 雌 株 一致 ， 是 一 较 大 的 异 染色质化 球形 深 染色 粒 ； 另 一 条 定名为 y染色体 的 随体 大部份 为 凝缩 程度 较 低 的 细长 染色 丝 ， 仅 在 中间 部位 有 一 个 较 小 的 染色 粒 ， 且 因 染色 丝 较 细长 使得 随体 部位 略 长于 x染色体 的 随体 部位 （ 图版I：9，11） 。 我们 观察 了 近 100个粗线期 的 PMCs，随体 染色体 的 这 种 不 完全 联会 行为 仅 为 雄株独有 ， 雌 株 中 未 发现 ， 表明 二倍体 中华 猕猴桃核仁 染色体 随体 部位 的 差异 与其 性别 有关 。 雄株核仁 二价体除 随体 以外 的 其它 绝大部份 （ 约 6/7以上 ） 能 完全 配对 ， 形态 与 雌 株 一致 ： 短 臂 近次缢痕 处 和 近 着丝点 区 各 有 1 个 较 深染 的 异 染色质化 大 染色 粒 ， 长臂未见 明显 染色 粒 ， 显示 该 二价体 具 极 高 的 同源 性 （ 图版I：7，9，11） 。 
在 其它 个别 已 配对 同源 染色体 上 也 可偶见易位 环 （ 图版I：7） 和 末端 倒 位 以及 疏松 配对 等 染色体 结构畸变 ， 但 不 出现 在 特定 的 染色体 上 ， 更 不 是 两性 间 有 规律 的 差异 ， 可以 判定 与 性别 形成 无关 。 上述 雌 、 雄株PMCs F1、F2期 的 异常 行为 可能 与 这些 染色体 结构畸变 中 不 稳定 的 结构畸变 有关 ， 而 稳定 的 结构畸变 在 个体 间 遗传 与 变异 的 意义 还 有待 于 更 进一步 的 研究 。 
根据 雌 、 雄株PMCs核仁 二价体 在 粗线期 的 配对 行为 ， 并 结合 其 两性 间 特有 的 配对 差异 ， 我们 认为 二倍体 中华 猕猴桃 的 核仁 染色体 与 性别 有关 ， 且 性别 决定 区域 在 随体 部位 ； 核仁 二价体 具有 很 高 的 同源 性 ， 表明 性 染色体 尚 处于 初级 分化 阶段 ， 雄株为 异配性 ， 雌 株 为 同 配性 ， 性别 决定 可判为 xx/xy型 。 


 讨论 
中华 猕猴桃 植物 雌花 有 外观 正常 的 雄蕊 群 ， 但 小孢子 败育 ； 雄花 有 退化 子房 ， 但 无 胚珠 发端 ， 与 具 严格 的 单性花 雌雄 异株型 植物 相比 ， 其 雌 、 雄花 发育 处于 单性花 低 水平 阶段 。 猕猴桃 植物 的 性别 一旦 形成 ， 一般 不可逆行 。 据报 道 ， 多 种 化学 （ 包括 多 种 植物 激素 ） 和 物理 （ 包括 切割 等 ） 刺激 方法 均 未 能 阻止 雌蕊 群 或 雄蕊 群 既定 的 选择性 败育 发生 ， 也 未 能 改变 猕猴桃 植物 原有 的 性别 类型 [ ] 。 植物 个体 间 具有 遗传 上 的 雌雄 异株性 ， 其 性别 表达 类型 的 复杂性 和 特殊性 使得 它 的 性别 决定 和 性 染色体 的 存在 与否 一直 是 热门 课题 。 
Testolin et al. （ 1995） 根据 美味 猕猴桃 结实 雄株自交 后代 性 比 分析 ， 推测 猕猴桃 植物 性别 是 由 xy性 染色体 或 由 一 对 或 几 对 等 位 基因 所 决定 [ 19] 。 Harvey et al. （ 1997） 根据 性别 遗传 交换 仅 发生 在 雄株 而 不 见于 雌 株 的 现象 ， 支持 了 性别 决定 基因 定位 在 一 对 染色体 上 的 观点 ， 但 他 认为 这 对 染色体 在 细胞 学 水平 难以 辨别[6] 。 Zhang et al. (1983) 利用 二倍体 和 四 倍 体植株 染色体 数目 , 推测 中华 猕猴桃xy性 染色体 的 存在 [ 20] 。 Nakajima (1942) 发现 狗枣 猕猴桃 （ A. kolomikta） 和 葛枣 猕猴桃 （ A. polygama） 雄性 植株 花 粉母细胞 中期 1有 一 对 异形 二价体 ， 认为 它们 就 是 性 染色体 ， 属 xy型[] 。 本 文 通过 核 型 和 粗线期 形态 分析 ， 认为 二倍体 中华 猕猴桃核仁 染色体 存在 着极 高 的 同源 性 ， 但 与 性别 决定 有关 。 性别 决定 不 是 通过 整 个 核仁 染色体 ， 而是 在 有异 染色质化 程度 差异 的 随体 区域 内 ， 尚 处于 性 染色体 初级 分化 阶段 ， 性别 决定 为 xx/xy型 。 
 目前 ， 对 同 形性 染色体 在 雌雄 异体 的 低 等 脊椎 动物 中 的 研究 较为 深入 [ ] ， 如 利用 复制 带 技术 ， 通过 同源 染色体 对 之间 某些 狭小 区域 上 与 性别 相关 的 复制 不 同步 现象 ， 来 确定 “处于 早期 分化 阶段 的 性 染色体 ” 的 存在 ， 并 认为 这 种 微弱 的 分化 可能 是 造成 早期 同源 染色体 对 之间 形成 隔离 的 原因 之 一[22] ； 或者 利用 减数 分裂 时期 一 对 同源 染色体 分离 较 早 于 其它 同源 染色体 的 现象 ， 判断性 二价体 之间 的 异质性 [23] ； 或 根据 粗线 期性 二价体 和 常 染色体 不同 的 形态学 特徵 ， 如 性 染色体 的 不 完全 配对 或 性 泡 等 ， 确认性 染色体 存在 [23] 。 然而 ， 有 花 植物 仅 在 极 少数 雌雄 异株物种 中 发现 有 性 染色体 存在 。 由于 这些 植物 具有 一 对 高度 异形 的 性 染色体 ， 因而 可以 通过 核 型 分析 予以 识别 （ 管 启良 1993）[23] ， 或 利用 它们 在 性 母细胞 减数 分裂 M1期 的 特殊 构型 予以 推测 。 本 研究 则 表明 ， 根据 粗线期 染色体 具有 较 高 形态 结构 分辨 力 和 同源 染色体 联会 行为 的 细胞 学 特徵 ， 可以 研究 尚 处于 早期 分化 阶段 的 性 染色体 并且 识别 核 型 分析 中 不易 识别 的 同源 染色体 上 的 结构 差异 。 此外 ， 粗线期 染色体 还 有 一 个 突出 的 优点 ， 即 同源 染色体 结构 上 的 差异 以及 差异 位置 可以 由 同源 染色体 的 细胞 学联会 行为 特徵直观 显示出来 。 总之 ， 粗线期 染色体 形态 分析 可以 为 研究 雌雄 异株植物 （ 特别 是 具 小 染色体 的 雌雄 异株植物 ） 性别 决定 机理 提供 一 种 有效 的 手段 。 
值得 一 提 的 是 ， 有关 猕猴桃xy性 染色体 随体 部位 表现 的 异 染色质化 形成 的 原因 ， 究竟 是 x染色体 随体 部位 出现 高度 重复 的 卫星 DNA（ 异 染色质化 ） ， 还是 y染色体 经 一 个 x染色体 随体 部位 发生 末端 断裂 ， 丢失 部份 DNA所致 ， 拟 或 其他 原因 ， 由于 无 合适 的 近 缘 植物 染色体 资料 作 参考 而 不能 判断 。 然而 ， 其随体 部位 的 异 染色质化 差异 可能 是 造成 早期 同源 染色体 对 之间 形成 隔离 的 一 个 原因 。 人们 通常 认为 异 染色 质 在 基因 活动 中 起 着调节 作用 ， 也 有 人 认为 异 染色质化 与 性 染色体 形成 有 一定 关系 。 如 Singh（1979） 认为 蛇类 性 染色体 形成 的 第一 步 是 性 染色体 上 出现 了 异 染色质化 。 吴政安 等 （ 1987） 认为 四川湍蛙y染色体 上 有 初步 的 异 染色质化 特 征 。 在 雌雄 异株植物 中 ， 也 有 核仁 染色体 或 异 染色 质 与 性别 决定 有关 的 报导 ， 包括 陈 可 咏 （ 1987，1995） 对 裸子 植物 粗榧、青 千 、 银杏 的 性 染色体 的 研究 [ ] ， 以及 Michiharu（1957） 对 蕨类 植物 羽苔属 （ Plagiochila） 的 性 染色体 研究 等 [  ] 。 我们 认为 ， 性 连锁 行为 可能 导致 染色体 上 的 异 染色 质 发生 特殊 类型 的 功能 调节 ， 这 种 调节 有 可能 对 性别 决定 及 生长 发育 产生 一定 影响 。 

致谢	郝水 院士 、 钱 迎倩 教授 和 李懋 学 教授 对 本 项 研究 提供 宝贵 意见 。 刘念 研究员 提供 水 东哥 材料 。 在 此 一 并 表示 衷心 的 感谢 ！ 

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